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基因工程在观赏植物花色育种中的应用
郑 丽 赵大克 贾 平
（云南农业大学园林园艺学院 昆明650201）
关键词 基因操作 观赏植物 花色育变
Abstract: The molecular mechanism of plant anthocyanin biosynthetic and the structural and regulatory genes controlling flower color in this pathways were expounded, the strategies and methods of genetic modification of color of ornamental plants were highlight.
Key Words: Genetic Manipulation; Flower Color; Ornamental Plants
人类的社会属性决定人在解决了丰衣足食的基本物质需求后，必然追求更高层次的精神享受。而花卉作为令人赏心悦目的高等植物，近年来随着人们生活水平的提高、物质条件的改善，它已越来越紧密地与人类社会联系在了一起。从争奇斗艳的时令鲜花到古朴端庄的盆景树桩，从摇曳缤纷的色香姿形到寓意丰富的花德神韵，无不在人们的生活中异彩流光，同时也在昭示着人类文明的进步。也正因为如此，人类永远都在追求新奇之美，对花卉也不例外。自从1983年美国人首次成功地获得抗卡那霉素的烟草再生植株以来，转基因技术已对人类的生活产生了巨大的影响。随着基因分离、基因载体的构建、植物遗传转化系统的完善和外源基因在植物细胞中的表达等方面研究的深入，人类获得了一系列品质优良、抗性强的转基因植株[4、9、11]。毫无疑问，将转基因技术应用于观赏花木领域，不仅能满足人类对新、奇、艳花卉的追求，解决传统育种工作尚无法克服的技术难题，同时，与粮食、蔬菜等作物相比，由于观赏植物仅供观赏而非食用，就其安全性而言，更容易被人类接受，具有更大的商业价值；更重要的是，以观赏植物为研究对象从事基因工程操作，科学家们可以更大胆地去揭示未知领域的奥秘。
1 花色的形成及其决定因子
1．1 花色素的生物合成及限速酶
在植物中决定花卉颜色的物质主要有类黄酮、类胡萝卜素及甜菜素这三大类色素，它们均是分子量不足300道尔顿的次生代谢物，存在于液泡中，其中，尤以类黄酮色素中的一类主要色素——花色素苷对花色的决定作用研究得较为深入，目前已知它在花色形成中起着非常主要的作用[1、3、10]。花色素苷包括花青素、花葵素、翠雀素等，它们控制着花的粉红色、红色、紫罗兰色及蓝色。花色素在花瓣中的含量增高或降低，都会改变花的颜色。例如在一种浅粉色的玫瑰“蝴蝶夫人”中，花色素只占花瓣干重的0.01%；而在黑色的郁金香“黑夜皇后”中，花色素则占干重的15%[6]。
图1 花色素的生物合成途径
PAL。苯丙酮氨酸氨基裂解酶C4H。苯丙烯酸羟化酶4CL。4-香豆酸辅酶A连接酶CHS。查尔酮合酶CHI。查尔酮异构酶 30Hase。黄酮醇-3-羟化酶 DFR。二羟基黄酮醇还原酶 UFGT。UDP-葡萄糖类黄酮糖基转移酶
花色素合成的生物途径如图1所示[6、16]。它们的最初前体是苯丙酮氨酸，在PAL、C4H作用下生成香豆酸辅酶A；然后一分子的香豆酸辅酶A和三分子的丙二酸单酰辅酶A，经苯基苯乙烯酮合成酶（查尔酮合酶CHS）的催化，缩合产生黄色的四羟基苯基苯乙烯酮（又称查尔酮），该步骤是花色素苷生物合成过程的限速步骤。因此，查尔酮合酶是对花色素合成及花色形成非常重要的一个酶，它在植物体内表达的量都可能影响花的颜色。邵莉，李毅1995[6、7]，用矮牵牛（Petunia hybrida）作为模式植物，借助基因工程的方法将外源查尔酮合酶基因导入植物体内，通过改变查尔酮合酶的含量，从而改变了花的颜色。
１.２ 影响花色的其它因子
图2 编码F3’5’H酶基因的表达使花色素苷生物合成趋向与产生翠雀素
研究发现，增加花色素B环的羟基化作用，增加液泡液的PH值及增加共着色（Co-
pigmentation），可导致花色更多地趋向于蓝色[3]。而在采用传统方法检测到的花色素苷中，没有发现在B环5’端能发生羟基化的，这就是为什么自然界中很少有蓝色花的缘故。但是通过基因工程技术，现已经分离出与蓝色形成密切相关的基因。Holton,T.A.[13]，1993，在矮牵牛中克隆到两个编码F3’5’H酶的基因Hf1和Hf2，这两个基因的表达都能使花色素苷生物合成途径趋向于产生蓝色的翠雀-3-葡萄糖苷，从而使花趋向于显蓝色，见图2；同样，当液泡中的PH值接近7时，花也可以显蓝色，PH 值较低时，花趋向于显红色，较高时则趋向于白色。Chuck,G[12]1993，从矮牵牛中分离到了一个能调控花卉PH值的基因PH6。Holton[14]1993, 报道从矮牵牛中克隆并表达了辅色素（co-pigments）黄酮醇合成酶基因F1，增加这种辅色素通常也会使花显蓝色。
１.２.２ 病毒感染引起的花色变异
段永嘉[2]1998，从在昆明、玉溪、楚雄、曲靖等地区采集到的郁金香、香石竹、紫罗兰、唐菖蒲、虞美人等几种花上，发现病毒侵染可产生杂色花，这些花的观赏品质因而得到提高。他们经过6-7年的研究得出结论：凡有病毒感染而引起的杂色花，每个花瓣所表现出来的班驳或条纹都不一样，由此认为，可能这是由病毒RNA和花卉本身具有的RNA杂交所产生的一种症状。
以上是关于花色的几点成因，以及在色素生物合成过程中起关键作用的酶等因子。以下就花色素苷生物合成基因的结构、功能和相互作用进行阐述。
２ 花色素苷生物合成的结构基因和调节基因
２.１ 结构基因
2.1.1 结构基因克隆
对花色素苷合成的遗传学研究起始于孟德尔对豌豆花色的遗传研究。早期的研究是将基因位点与易观察的色彩变异联系起来进行。近60年来，对花色素代谢的遗传学和生物化学进行了全面而深入的研究。在花色素苷及其它类黄酮物质的结构确定后，才将单一基因与相应的花色素苷对应起来。目前的研究主要围绕着花色素苷基因的突变进行[1]。
结构基因直接编码花色素苷代谢生物合成酶类，利用蛋白质纯化、转座子标签、PCR及鉴别筛选等手段，已从矮牵牛、玉米、金鱼草等植物中分离并克隆了CHS、CHI、F3H、DFR、3GT等近10个结构基因，其中从矮牵牛中分离的最多[11]。
２.１.２ 结构基因启动子功能
将结构基因启动子不同长度片段分别与CAT、GUS等报告基因融合构成嵌合基因，导入植物，检测CAT、GUS活性，便可分析研究结构基因启动子分子生物学功能。Vander Meer[22],早在1990年就通过实验证实矮牵牛花200bpCHSA启动子片段含一段赋予特异和UV-可诱导的表达的顺式激活序列。Van Tunen[23、24]1991证实，CHI-A基因编码区上游存在两个启动子PA1和 PA2，且二者在不同的矮牵牛花组织中有不同的驱动活性。PA1 启动子在花冠组织中驱动CHIP-A基因表达，而PA2启动子仅仅在花药发育后期和花粉粒组织中驱动CHIP-A基因表达。CHI-B基因只具有一个启动子，仅在花药发育早期（未成熟的花药发育组织）驱动其表达。CHIP-A和CHI-B基因启动子区域存在37bp的高度保守DNA序列。其它花色素苷合成酶结构基因CHS和DFR启动子DNA序列也存在一段与CHI基因启动子相似的高度保守的DNA序列，称之为花药盒（anther box）[10]。推测此段序列可能在花药特异的基因表达方面起着重要的调控作用。以此推断为基础，Van der Meer[25]1992，合成了一段28bp的 DNA序列，（与DHI-B启动子区域的保守序列完全相同），插入35S启动子—90bp处，与GUS基因编码片段构成融合基因，导入矮牵牛发现GUS表达在花药、花冠组织中明显提高。
２.２ 调节基因
2．2．1 调节基因克隆
影响花色素苷代谢的调节基因，控制着结构基因表达的强度和程式。与结构基因克隆相比，调节基因克隆主要采用转座子标签技术，在已有基因分离的基础上，并以其作探针来分离后来的基因。目前克隆到的此类基因大多来自玉米、金鱼草及矮牵牛的不同位点[1]，自1988年首次分离出R基因以来，又先后分离R族的其它基因S、SN、LC等 [11]。
发现在玉米中R、Sn Lc和B基因的序列相似，C1和PL基因也属同源；从金鱼草中克隆到DeL基因与R族基因序列高度相似；矮牵牛中分离到An2基因的序列与玉米C1 和PL基因高度相似。由此可见，不同物种中花青素的生物合成由相似的因子介导[1]。
2．2．2 调节基因的分子生物学功能
依据调节基因R、B、C1、PL、P、DEL和DNA序列，推测它们的基因产物均具备转录因子的结构功能[10]。目前，主要采取两种实验方法证实这一推测。一种是研究调节基因的特异性及与它所调控的结构基因启动子DNA的结合活性，另一种更加直接的基因调控研究是利用玉米糊粉层和胚组织瞬间表达系统。Klein[17]1989，利用基因枪法将结构基因al(DFR)和bzl(UF3GT)分别导入相应突变型的玉米糊粉层和胚组织，产生粉红色色素沉积、互补结构基因突变体。将以上二结构基因的启动子与荧光素报告基因融合，分别导入C1R、clR、C1r和clr基因型的玉米糊粉层和胚组织，C1R基因中，荧光素酶活性比在C1r、clR和clr基因型中的高2000倍。说明al和bzl基因启动子诱导启动依赖于ClR的同时存在，进而证实al和bzl结构基因在糊粉层表达需要Cl和R基因调控，而其它3种基因型则不能诱导al和bzl启动子转录[17]。
第一个利用调节基因互补实验研究的是CaMV35S启动子控制下R（Lc）编码序列[18]。这种组成型启动子可启动花色素苷在组织内表达沉积。扩展的R基因表达模式仍然受到PL基因或光的限制，说明R/B型蛋白质的组成型表达于花色素苷沉积并非是充分的。
２. ３ 外源花色素苷结构基因的表达和调控
花色素苷生物合成系统是研究基因表达和调控的最佳系统之一。花色素苷生物合成结构基因和调节基因表达的改变，引起表型改变最终导致花色发生改变。Linn证实单拷贝al转基因矮牵牛花色表现型为红色，多拷贝al 转基因矮牵牛表现型仍为白色，启动子甲基化抑制al基因表达。Meyer等详细研究了al基因拷贝数、DNA甲基化状态、整合位点和整合区域染色体甲基化状态以及内源和环境因素对al基因DNA甲基化影响等方面的基因表达和调控等问题指出，外源al基因DNA甲基化状态使al基因在转基因植物内表达水平不稳定；整合区域染色质超甲基化状态辐射影响转基因DNA甲基化，从而使al基因表达水平低下甚至不表达 [10]。 http://www.yunnan-flower.org.cn)
２.４ 外源和内源结构基因相互作用
将克隆的花色素苷生物合成结构基因导入植物细胞内，可导致同源的内源结构基因表达改变，CHS或DFR导入矮牵牛植株，导致同源的内源结构基因表达受抑制，其效果与被导入基因的同源性密切相关，且内源和外源同源基因表达同时受抑制，其它结构基因可正常表达，此现象被称为共抑制现象[10]。
３ 花色基因工程操作的方法
３.１直接导入外源结构基因法
对于单基因控制的花色，如果物种或品种本身缺乏该基因，可直接导入外源结构基因改变花色。Meyer,P用此方法完成了世界上首例基因工程改变花色的实验。他们将玉米DFR基因导入矮牵牛RL01突变体后，使二氢堪非醇还原，从而提供了天竺葵色素生物合成的中间产物，使花色变成淡砖红色。邵莉、李毅1995，从矮牵牛特定发育阶段的花瓣的DNA中，克隆到CHS基因，正向克隆到含有CMV35S启动子的中间载体中，通过土壤农杆菌介导的方法转化矮牵牛，转基因矮牵牛花色发生了明显变化[6、7]。荷兰S&G种子公司则将玉米DFR基因导入矮牵牛后，再将转基因植株自交，培育出鲜橙色矮牵牛。同样的原理还有人将非洲菊和月季DFR基因转入矮牵牛[6、13]，得到与此相似的植物花色变异。
３.１ 反义RNA技术和共抑制法
1988年荷兰自由大学首次采用反义RNA技术获得了按花色变异新品种，他们将CHS的结构基因反向导入矮牵牛植株后，转基因植株表现出不同程度的花色变异图案[21]。1994年，美国加利福尼亚洲奥克兰港的DNA公司Courtney-Gutterson[3]通过根癌农杆菌介导转化法将一个从菊花中分离到的CHS基因以反义方向导入开粉红色的菊花品种“Moneymaker”中，结果在83个反义转化株中，有3株开白色花和极淡粉色花，对照处理没有能够形成开白色花的植株。进一步研究表明，转基因植株开白花性状可以通过营养繁殖稳定地遗传下去。还发现，从开白花的菊花中分离出少数开粉红色花的菊花，推测可能是反义RNA未能完全抑制内源CHS基因表达的缘故。
研究发现，当CHS有多拷贝导入植物体内时，植物的内源CHS便局部或全部不能表达，从而形成白色花和图案变化十分丰富的彩瓣花。这便是基因的共抑制现象，Courtney-Gutterson采用基因的共抑制原理，将菊花的CHS基因以有义方向导入菊花园艺品种后，133株有义转化株中有3株花色发生了变异[3]。
３.１.１ 调节基因导入法
当植物体内本身含有花色素代谢的结构基因，由于组织特异性或缺乏调节基因表达产物的激活而不表达时，可通过导入调节基因并使其适当表达而改变植物花色。该方法已经在矮牵牛上获得了成功[1]。
３.１.２ 多基因控制花色的综合调控
自然界中蓝色的花卉较之于红色、黄色等花卉明显稀有，尤其是五大切花中都缺蓝色系。因为这些蓝色花的形成需要多基因控制，例如培育蓝色月季需要同时具备三个条件：翠雀素的合成、黄酮醇共染剂和较高的PH值。目前，蓝色有关基因的研究已取得重要进展，如控制PH值基因的获得等 [1]。 http://www.yunnan-flower.org.cn)
４ 展望与问题
４.１ 花色素代谢相关基因的其它用途
通过遗传转化的方法，根据所转移的结构基因和调节基因，可以分析推测某一物种的花色素代谢途径，揭示某一花色的缺失究竟是植物体内没有此合成途径还是内源基因不能活化所致。利用调节基因的导入在一定程度上影响植物的其它性状[7]，可从另一侧面研究植物的发育；
另外，因花色素代谢过程中，基因表达的结果在外观显而易见，花青素代谢调节基因堪称最方便的植物遗传转化报告基因。所以，可利用其研究更广泛领域植物基因的表达及相互作用，尤其在研究基因共抑制、转基因沉默等方面[1]。
４.２ 应用基因工程改变植物的其它观赏品质
在研究花色素结构基因和调节基因的同时，发现调节基因的导入不但能改变花冠颜色，还能使其它组织发生色彩变异[20]。因此，在综合研究花色素结构基因和调节基因的基础上，选用具有器官特异性的启动子，将有可能培育出彩色植株。
除了对花色进行转基因工程的研究且取得一定成绩之外，目前转基因技术已被越来越多地应用于改变观赏植物的其它品质。例如，法国科学家利用野生型发根农杆菌转化柠檬天竺葵，已成功地获得高含量芳香物质的转化株，有望在花香基因工程操作领域中开拓一条如同于花色基因工程操作的途径[3]。
国人赏花注重色、香、姿、韵，就花卉形态的基因工程操作目前鲜有报道，但就植株形态改变的基因研究已有了一些成果。有人分离出控制雄蕊转化为花瓣、心皮转为萼片、萼片转为叶片的基因[3]；日本信洲大学的小岛博士等，已非常成功地将小麦的分支基因转化到荞麦中[26]；这些工作都将为人类利用基因工程手段修饰花卉的形态打下良好的基础。
有关花卉其它方面的品质基因如：切花的保鲜及延缓衰老基因、抗环境胁迫基因、抗病虫害基因等也正一步步得到发展[4、5、8、9、11]。
纵然观赏植物的基因工程操作在今后可能有很好的发展前景，但目前存在以及今后可能发生的一系列问题仍然是阻碍这一技术发展的关键。总的来说，可将这些问题归为三大类：
技术问题：花卉基因工程（尤其在我国）处于起步阶段，许多领域尚属空白且存在诸多技术不完善的地方。如细胞培养和分化诱导技术有待进一步提高，细胞分化诱导技术直接影响到基因工程能否开展并走向实用[11]。虽然在观赏植物中已有许多品种建立了转化体系，但转化频率仍然不高，对梅花、牡丹等观赏价值较高的花卉尚无研究；即使对目前已建立了较为成熟的转化体系的矮牵牛而言，其花色的改变仍然存在着很大的随机性；且在影响花色形成的诸多色素中，研究工作多集中于类黄酮中的花青素，而对翠雀素、花葵素等研究甚少，类胡萝卜素、甜菜素等更稀有探索。
社会问题：目前我国尚未形成完备的花卉育种体系，包括技术体系和管理体系。本来就不足的研究力量过于分散，各有关部门、行业、学科之间缺乏有效的交流与合作。由于缺乏循序渐进、从基础到深入的研究系统，加之一些急于求成的指导思想，致使研究资金的投入和管理具有一定的盲目性和浪费现象。 http://www.yunnan-flower.org.cn)
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来源：云南花卉信息中心
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